МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР
ПИСЬМО
12 октября 1989 г.
N 21-08/11-297
О ПОВЫШЕНИИ КАЧЕСТВА ЛЮМИНЕСЦЕНТНО-МИКРОСКОПИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ
МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА (МБТ)
Практическими и научно-исследовательскими учреждениями
приобретен достаточно большой положительный опыт по
совершенствованию люминесцентной микроскопии для диагностики
бактериовыделения у больных туберкулезом, позволяющий повысить
результативность указанного анализа, сократить затраты рабочего
времени в отдельных моментах исследования и обезопасить персонал
при работе с вирулентной культурой.
Руководителем микробиологической лаборатории НПО
"Фтизиопульмонология" д-р мед. наук В.М. Должанским, зав.
лабораторией Московского противотуберкулезного диспансера N 4 Н.Ф.
Жаком и врачом Е.М. Морель на основании анализа опыта применения
люминесцентной микроскопии в противотуберкулезных учреждениях
подготовлены предложения по совершенствованию существующего
метода.
В зависимости от возможностей лабораторий окраска мазка
производится по Хагеманну или по Бою. Последний метод нашел
меньшее число последователей из-за дефицитности и высокой
стоимости одного из основных красителей (родамина), поэтому в
настоящем письме акцент сделан на окраску по Хагеманну, но учтены
и особенности окраски по Бою.
Окраска по Бою сложнее окраски по Хагеманну и много дороже. Ее
внедрение во многих лабораториях определяется большим объемом
информации, получаемой микроскопистом при использовании данной
методики: снижается риск выдачи положительного ответа при
обнаружении сапрофитной флоры, появляется возможность
дифференцировать возраст микобактериальных клеток и т.д. Однако
тонкая дифференцировка, достигаемая при окраске по Бою, требует и
дополнительных затрат времени. Так, при изготовлении мазка из
осадка материала, подготовленного для посева, необходимо прямо на
предметном стекле проверить рН суспензии и добиться его значения в
6,5-7,0 единиц (проверяется мелкими лакмусовыми бумажками). Для
подщелачивания используют 0,5% раствор NаОН, для подкисления -
0,5% раствор HCl. Для окраски по Хагеманну эта процедура
необязательна.
При всех видах окраски абсолютно необходима плотная фиксация
мазка на стекле. Жидкий материал (мочу, экскрет после ингаляций,
ликвор и т.д.) обязательно наносят на предметные стекла,
предварительно смазанные взбитым яичным белком. В условиях
холодильника такие стекла хранятся неограничено долго и могут
заготавливаться впрок.
Не следует спешить с термальной фиксацией мазка. Вначале мазок
подсушивают на воздухе - на нем не должно оставаться мелких капель
- затем фиксируют в сухожаровом шкафу при 90°С в течение 30 минут.
Отсчет времени начинают с момента достижения температуры 90°. При
этом происходит не только хорошая фиксация материала, но и
дальнейшая работа с мазком становится безопасной.
Оригинальный метод окраски разработан в Московском
противотуберкулезном диспансере N 4. В настоящее время этим
простым и надежным методом пользуются практически все лаборатории
Москвы.
Реактивы: 1) 10% раствор Na3PO4
2) 5% раствор карболовой кислоты
3) 0,1% раствор аурамина
Для лучшего растворения аурамин в течение суток выдерживается
в термостате. Перед употреблением растворы аурамина и карболовой
кислоты профильтровываются через обеззоленный бумажный фильтр. Эти
растворы готовят из расчета недельной потребности.
4) 3% солянокислый спирт
5)Раствор кислого фуксина: 390 мл дистиллированной
воды, 1 грамм кислого фуксина и 10 мл ледяной уксусной кислоты.
Перед употреблением кислый фуксин профильтровать через
обеззоленный бумажный фильтр. Растворы солянокислого спирта и
кислого фуксина можно готовить впрок.
Отличием от рутинного метода Хагеманна нужно считать 2
основных момента:а) раствор аурамина готовят без добавления
карболовой кислоты и б) мазок перед окраской заливают раствором
карболовой кислоты, что выравнивает рН всей поверхности мазка,
улучшает и ускоряет проникновение краски в клетку возбудителя, а
это способствует хорошему свечению клеток по всей просматриваемой
площади.
Ход работы (экономный вариант). Материал обрабатывается 10%
раствором Nа3РО4 18-24 часа в термостате.
На следующий день из плевательниц осторожно сливают верхний
слой жидкости, горлышко плевательницы фламбируют на пламени
горелки, осторожно перемешивают содержимое плевательницы и
разливают по центрифужным пробиркам. Горлышко центрифужки
фламбируют на пламени горелки. Если материал идет на посев и
бактериоскопию, содержимое плевательницы разливают в две
центрифужки.
Приготовление мазков
Центрифугирование - 2000 об/мин. 15 минут. Надосадочную
жидкость полностью сливают. Горлышко центрифужки фламбируют на
пламени горелки.
Осадок энергично взбалтывают и 1-2 капли через край наносят на
предметное стекло. Горлышко центрифужки фламбируют на пламени.
Донышком центрифужки на предметном стекле делают не толстый
круглый или овальный мазок.
Окраска: а) мазки раскладывают на рельсы и заливают 5%
раствором карболовой кислоты на 2 минуты. Через 2 минуты р-р
карболовой кислоты с мазков сливают, торец стекла высушить
фильтровальной бумагой;
б) без промывки мазков на них наносят 0,1 р-р аурамина на 2
минуты;
в) мазки промывают с тыльной стороны проточной водой;
г) обесцвечивание 3% солянокислым спиртом дважды по 2 минуты;
д) промывка с тыльной стороны струйкой воды;
е) мазки заливают р-ром кислого фуксина на 2 минуты;
ж) промывка стекол с мазками с тыльной стороны. Сушка на
воздухе.
Микроскопия
Аналогично можно готовить мазки для окраски по Цилю-Нильсену
взамен исследования флотационного кольца, но при этом исключается
обработка мазков карболовой кислотой.
Метод информативен, прост, позволяет экономить лабораторную
посуду, повысить производительность труда, рекомендуется к
повсеместному внедрению.
|
