МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР
ПРИКАЗ
29 января 1981 г.
N 98
О РАСШИРЕНИИ ФУНКЦИЙ BCEСОЮЗНОГО ЦЕНТРА
МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
В последние годы в нашей стране наблюдается стабилизация
уровня заболеваемости менингококковой инфекцией, но на отдельных
территориях еще регистрируются подъемы заболеваемости, что может
быть следствием недостаточной этиологической расшифровки гнойных
менингитов, в частности, вызванных гемофильной палочкой и
пневмококками.
Отсутствие этиологической расшифровки гнойных менингитов ведет
к гипердиагностике менингококковой инфекции и затрудняет
своевременное проведение этиотропной терапии.
В целях снижения заболеваемости менингококковой инфекцией и
гнойными менингитами другой этиологии, обеспечения методического
руководства профилактики и лечения менингитов
ПРИКАЗЫВАЮ:
1. Расширить функции Всесоюзного центра по менингококковой
инфекции с возложением на него обязанностей по этиологической
расшифровке гнойных бактериальных менингитов, обратив особое
внимание на гемофилы и пневмококки.
2. Внедрить в практику бактериологических лабораторий при
опорных базах обязательное проведение этиологической расшифровки
гнойных бактериальных менингитов.
3. Переименовать Всесоюзный центр по менингококковой инфекции
при ЦНИИ эпидемиологии Минздрава СССР (в дополнение к приказу
Министра здравоохранения СССР N 559 от 25 июля 1973 г.) во
Всесоюзный центр менингококковой инфекции и гнойных бактериальных
менингитов.
4. Утверждаю список опорных баз Всесоюзного центра с
обязательным включением в состав ответственных лиц по опорной базе
врачей инфекционистов и бактериологов (Приложение N 1).
5. Всесоюзному центру менингококковой инфекции и гнойных
бактериальных менингитов обобщать оперативную информацию опорных
баз в виде ежегодных "Информационных писем" и представлять в
Главное управление карантинных инфекций Минздрава СССР.
6. Утверждаю методические указания по бактериологической
диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов
для практических врачей (Приложение N 2).
Министерствам здравоохранения Союзных республик, Министерствам
и ведомствам СССР, имеющим медицинскую службу, разрешается
размножить настоящий приказ в необходимом количестве экземпляров.
Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на
начальника Главного управления карантинных инфекций Министерства
здравоохранения СССР тов. Сергиева В.П.
МИНИСТР
С.П.БУРЕНКОВ
Приложение N 1
к приказу Министерства
здравоохранения СССР
от 29.01.1981 г. N 98
ПЕРЕЧЕНЬ
ОПОРНЫХ БАЗ ВСЕСОЮЗНОГО ЦЕНТРА МЕНИНГОКОККОВОЙ
ИНФЕКЦИИ И ГНОЙНЫХ ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНЫХ МЕНИНГИТОВ
1. Армянский ордена Трудового Красного Знамени научно -
исследовательский институт эпидемиологии, вирусологии и
медицинской паразитологии им. А.Б.Алексаняна и городская
инфекционная больница г.Еревана.
2. Архангельская областная санитарно - эпидемиологическая
станция ж городская инфекционная больница г.Архангельска.
3. Ашхабадский научно - исследовательский институт
эпидемиологии и гигиены и городская инфекционная больница
г.Ашхабада.
4. Белорусская республиканская санитарно - эпидемиологическая
станция министерства здравоохранения БССР и городская инфекционная
больница г.Минска.
5. Грузинская республиканская санитарно - эпидемиологическая
станция и республиканская клиническая инфекционная больница
г.Тбилиси.
6. Казахская республиканская санитарно - эпидемиологическая
станция Министерства здравоохранения Казахской ССР и городская
инфекционная больница г.Алма - Аты.
7. Киргизский научно - исследовательский институт
эпидемиологии, микробиологии и гигиены и городская инфекционная
больница г.Фрунзе.
8. Красноярская краевая санитарно - эпидемиологическая станция
и городская инфекционная больница г.Красноярска.
9. Литовская республиканская санитарно - эпидемиологическая
станция и городская инфекционная больница г.Вильнюса.
10. Ленинградская городская санитарно - эпидемиологическая
станция и городская клиническая инфекционная больница
г.Ленинграда.
11. Львовский научно - исследовательский институт
эпидемиологии и микробиологии.
12. Молдавский научно - исследовательский институт гигиены и
эпидемиологии и кафедра инфекционных болезней Кишиневского
медицинского института.
13. Новосибирская областная санитарно - эпидемиологическая
станция и городская инфекционная больница г.Новосибирска.
14. Хабаровская краевая санитарно - эпидемиологическая станция
и городская инфекционная больница г.Хабаровска.
15. Харьковский научно - исследовательский институт
микробиологии, вакцин и сывороток им. И.М.Мечникова и городская
клиническая инфекционная больница г.Харькова.
16. Ярославская областная санитарно - апидемиологическая
станция и городская клиническая инфекционная больница г.Ярославля.
Начальник Главного
управления карантинных
инфекций Минздрава СССР
В.П.СЕРГЕЕВ
< "Методические рекомендации по бактериологической диагностике
менингококковой инфекции и бактериальных менингитов"
утратили силу - Приказ Минздрава СССР от 01.12.1998 г. N 858>
Приложение N 2
к приказу Министерства
здравоохранения СССР
от 29.01.1980 г. N 98
В последние годы заболеваемость менингококковой инфекцией на
большинстве территорий нашей страны снизилась. На фоне снижения
этой заболеваемости увеличился удельный вес бактериальных
менингитов - другой этиологии. Недостаточное использование
лабораторных методов в этиологической расшифровке гнойных
менингитов, особенно гемофильной палочки и пневмококков, ведет к
гипердиагностике менингококковой инфекции, затрудняет
своевременное проведение этиотропной терапии, приводит к тяжелым
осложнениям и летальным исходам. В связи с этим целесообразно
направить внимание лабораторной службы инфекционных и клинических
больниц и СЭС на обязательное выявление этиологических факторов
при цереброспинальных менингитах /ЦСМ/.
Успешная борьба с бактериальными менингитами на современном
этапе тесно связана с усовершенствованием методов лабораторной
диагностики. В настоящих методических указаниях нашли отражение
результаты научных исследований последних лет в области изучения
биологических свойств рода Neisseria, Heinfluenxae и Str.
pneumoniae как отечественных, так и зарубежных авторов.
Методические указания предусматривают дифференциальную диагностику
на основе выделения чистой культуры в изучения всего комплекса
биологических признаков. Включен также ряд дополнительных методов
диагностики, экспресс - методы, рецепты приготовления питательных
сред и реактивов.
ПОКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ
Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и
бактериальных менингитов осуществляется бактериологическим методом
путем выделения и идентификации возбудителя и серологическим путем
выявления специфических антигенов в жидкостях тела /ликвор, кровь,
синусоидальная жидкость и др./. Лабораторное обследование проводят
с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям. С
диагностической целью обследуют больных с клинически выраженной
формой заболевания, стертой формой и с подозрением на
менингококковую инфекцию и менингиты.
По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в
контакте с больным менингококковой инфекцией, и реконвалесцентов
перед выпиской из больницы.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МЕНИНГОКОККОВОЙ
ИНФЕКЦИИ И ДРУГИХ ГНОЙНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕНИНГИТОВ
В связи с тем, что наряду с менингококком, наиболее частым
этиологическим фактором цереброспинального менингита является
пневмококк, а у детей младшего возраста Н.Influenzae,
представляется целесообразным изложение основных дифференциально -
диагностических признаков в методов выделения этих возбудителей.
По классификационной системе определителя Berdey /1974/
менингококк принадлежит к семейству Neisseriaeceae, роду
Neisseria. Род нейссерий включает два вида патогенных
микроорганизмов: N.gonorrhoeae и N.meninditiolis. остальные
представители этого рода являются резидентной флорой слизистых
оболочек. К последним относятся пигментообразующие N. perflava,
остальные представители этого рода являются резидентной флорой
слизистых оболочек. К последним относятся пигментообразующие N.
perflava, N. flava и N. subflfva объединенные в один вид N.
subflava, а также N. siccfa и N. flavescens, Катаральный диплококк
выделен в самостоятельный вид Branlamellf catarrhflis.
Менингококки очень требовательны к условиям культивирования:
не растут на простых питательных средах, требуют сред, богатых
аминокислотами, однако при выделении могут расти на простых
питательных средах, но только при наличии в них нативного белка.
При росте требует повышенной влажности и 5-10% содержания CО2 в
воздухе. В связи с этим питательные среды должны быть
свежеприготовленными с содержанием агар - агара в них в пределах
1,2-1,5% /при применении порошковидного агар - агара/. В качестве
источника нативного белка рекомендуется применять сыворотку
крупного рогатого скота, лошадиную сыворотку или кровь животного.
Для инактивации комплемента и ферментов сыворотки ее следует
прогревать при температуре 56 град. в течение 30 минут.
Наиболее оптимальные и доступные практике варианты рецептов
питательных сред даны в приложении N 1.
При приготовлении сред рекомендуется использовать бульоны из
рыбного гидролизата, сухого питательного бульона, сухого
питательного агара специального назначения /производство
Дагестанского научно - исследовательского института питательных
сред МЗ СССР /.
Менингококки очень чувствительны к малейшим отклонениям
температуры. Поэтому все посевы следует производить только после
предварительного подогрева питательной среды в термостате. Посевы
можно извлекать из термостата не более чем на 30 минут.
Идентификация вида N. meninditidis основана на комплексе
морфологических, тинкториальных и культуральных признаков /таб.1/.
Менингококки, как и все нейсерии, представляют собой
неподвижные кокки, не образующие спор. В материале, полученном из
инфицированного организма /спинномозговая жидкость, кровь/,
бактерии окружены капсулами, которые выявляются в виде плохо
окрашенного ореола вокруг клетки. Бактериям свойственно парное
расположение. В культурах с искусственными питательными средами
эти признаки утрачиваются: ореол исчезает, клетки располагаются
беспорядочно.
При первом выделении клеткам менингококков свойственен
полиморфизм, который может утрачиваться при субкультивировании.
Полиморфизм клеток менингококков характерен для штаммов,
выделенных из ликвора и носоглотки. Он проявляется в различной
величине /встречаются гигантские клетки/ и неодинаковом
окрашивании клеток.
Нейссерии - грамотрицательные бактерии, но отношение к окраске
по Граму выражено у них недостаточно четко. Поэтому рекомендуется
проводить окрашивание по Граму в модификации Калины.
Менингококки не образуют пигмента. Колонии менингококков на
сывороточном агаре бесцветны, диаметром от 0,5 до 1,5 мм.
Пигментообразующие нейссерии иногда через 24 часа еще не
формируют пигмента, он накапливается в 48-72 - часовых культурах.
Колонии многих непатогенных нейссерий имеют крошащуюся или
тянущуюся консистенцию, что отличает их от колоний менингококков.
Для дифференциации N.meningitidis от непатогенных нейссерий и
Br.catarrgalis рекомендуется использовать признак, отражающий его
прихотливость, свойственную первым генерациям микроба.
При первичном выделении менингококк не способен расти на
бессывороточном агаре при температуре 37 град. С. Другой признак -
отсутствие роста менингококков на сывороточном агаре при
температуре 20 град., 22 град.,/ но не комнатная температура/. Это
свойство не является постоянным для непатогенных нейссерий,
которые при первичном выделении также могут не расти в этих
условиях, поэтому оно не оценивается как обязательное при
дифференциации бактерий. В отличие от непатогенных нейссерий
менингококки не растут на питательных средах с 5% желчи.
Среди биохимических свойств важным дифференциальным признаком,
особенно для штаммов менингококков, выделенных из носоглотки,
является ферментация углеводов. Согласно определителю Berdey для
менингококков характерна ферментация глюкозы и мальтозы до
образования кислоты. Некоторые ликворные штаммы менингококков при
первичном выделении обладают слабой ферментативной активностью,
что отражается в неспособности ферментировать оба или один из
углеводов. Субкультуры таких штаммов менингококков восстанавливают
нормальную сахаролитическую активность. Большинство непатогенных
видов нейссерий, в отличие от патогенных, способно при выращивании
на сывороточном агаре с 5% сахарозы образовывать крахмалоподобное
вещество /полисахарид/, которое выявляется с помощью водного
раствора Люголя, нанесенного на поверхность выросшей культуры.
Положительная реакция характеризуется появлением бурого
окрашивания культуры. Наличие ферментов оксидазы и каталазы -
признак, который нельзя оценивать как обязательный при
дифференциации менингококков. Эти свойства присущи всем нейссериям
и Br.catarrhalis. Однако по наличию или отсутствию каталазной или
оксидазной активности возможна дифференциация нейссерий,
гемофилов, пневмококков /табл.2/.
Серологическое группирование менингококков рекомендуется
проводить после окончательной видовой идентификации возбудителя,
что обусловлено общими антигенными факторами менингококков с
непатогенными нейссериями.
Менингококки делятся на несколько серологических групп:
А.В.С.Д.Х.У, ,W - 135 и 29-Е. Штаммы, выделенные из
носоглоточной слизи, в половине случаев не поддаются группированию
в реакции агглютинации по причине полиагглютинабельности или
аутоагглютинации. В этом случае использование метода преципитации
в агаре позволяет увеличить число группируемых культур. Проведение
серологического группирования менингококков является обязательным
для практических лабораторий, как одна из мер эпидемиологического
надзора за менингококковой инфекцией.
Хранение и транспортировка культур менингококков представляет
известные трудности. На плотных питательных средах культура
менингококков через 48 часов нахождения в термостате практически
не содержит жизнеспособных клеток. Наиболее длительно
жизнеспособность клеток сохраняется на средах полужидкой
консистенции - желточной среде Дорсе, 0,1% питательном агаре с
добавлением сыворотки. Для хранения культуры можно использовать
посев менингококков в сывороточный агар уколом с заливкой через
сутки поверхности среды стерильным вазелином при наличии роста.
Культуры хранятся в термостате или при комнатной температуре.
В настоящее время разработано несколько рецептов питательных
сред и способов транспортировки патогенного материала для посева
его в лаборатории /см. Приложение N 1/.
Следует отметить, что многократное культивирование
менингококков, длительное хранение их в условиях лаборатории ведут
к утрате ими основных дифференциально - диагностических признаков.
Они начинают расти на бессывороточных средах и при температуре 20
град. С. Усиливается сахаролитическая активность менингококков,
изменяется их антигенная структура, они теряют способность
агглютинироваться специфическими сыворотками. Поэтому для изучения
основных биологических признаков пригодны только свежевыделенные
штаммы /не более 3-4-й генерации/.
Для оценки лекарственной устойчивости можно использовать
культуры с более длительным сроком хранения. Оптимальные условия
сохранения исходных свойств возбудителя обеспечивает только
лиофильное высушивание культур.
Таблица 1.
КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
НЕЙССЕРИЙ И В. CATARRHALIS
-----------------T----------------------------------------------------------T-------¬
¦ ¦ Отношение к условиям культивирования ¦ ¦
¦ +----------------------------------------------------------+ ¦
¦ ¦ Рост на ¦Образо-¦
¦ Возбудители +----------T--------T------------T-----------T-------------+вание ¦
¦ ¦сывороточ-¦бессыво-¦сывороточном¦5% желчном ¦Зависимость ¦пигмен-¦
¦ ¦ном агаре ¦роточном¦агаре 20-22 ¦агаре с сы-¦роста от СО2 ¦та ¦
¦ ¦37 град. С¦агаре 37¦ ¦вороткой ¦при первичном¦ ¦
¦ ¦ ¦град. С ¦ ¦37 град. С ¦выделении ¦ ¦
+----------------+----------+--------+------------+-----------+-------------+-------+
¦N. gonorrhoeae ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦
¦N. meningitidis ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦
¦N. sicca ¦ + ¦или +- ¦ или +- ¦ + ¦ - ¦ - ¦
¦N. perflava ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ +- ¦
¦N. flava ¦ + ¦редко +-¦ редко +- ¦ + ¦ - ¦ + ¦
¦N. subflava ¦ + ¦редко +-¦ редко +- ¦ + ¦ - ¦ + ¦
¦N. flaverscens ¦ + ¦редко +-¦ редко +- ¦ + ¦ - ¦ + ¦
¦N. mucosa ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
¦Br. catarrahalis¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
L----------------+----------+--------+------------+-----------+-------------+--------
Х - тест использует как дополнительный при дифференциации
непатогенных нейссерий.
У = Признак недостаточно изучен.
К - Образование кислоты.
Нек.- некоторые штаммы.
I. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СПИННОМОЗГОВОЙ
ЖИДКОСТИ БОЛЬНОГО
1-й день обследования. Спинномозговую жидкость в количестве
2-5 м берут у больного сразу же при поступлении в стационар с
соблюдением всех правил асептики. Взятие ликвора проводится
персоналом в масках.
Первую порцию спинномозговой жидкости /около 1 мл/ берут в
отдельную пробирку для проведения общего ликворологического
исследования. Вторую порцию, предназначенную для
бактериологического исследования, наливают в стерильную
центрифужную или агглютинационную пробирку. Касаться руками краев
канюли, иглы и краев пробирки нельзя. Ватную пробку полагается
держать на весу за ее наружную часть. Если немедлен но доставить
жидкость в лабораторию невозможно, допустимо хранение ее в течение
нескольких часов в термостате при температуре 37 град. Во время
транспортировки спинномозговую жидкость следует тщательно
предохранят от охлаждения /например, доставлять в термосе/.
Спинномозговую жидкость исследуют немедленно при доставке в
лабораторию. Ликвор центрифугируют при 3,5 тыс. об/мин в течение 5
минут. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут
0,3-0,5 мл материала и по 2-3 капли засевают на поверхность 2
чашек Петри с подогретой питательной средой растирая шпателем.
Одна чашка содержит кровяной агар. Оптимальной средой является
агар с 5% крови животного. За неимением ее можно приготовить
"шоколадный" агар, используя стерильную кровь любого
происхождения. Вторая чашка с простым питательным агаром. Посевы
ставят в термостат при температуре 37 град. и создают условия
повышенного содержания СО2 в воздухе /см. Приложение N 1/.
Спинномозговую жидкость, оставшуюся в пробирке, используют для
посева на среду "обогащения" /полужидкий агар/ в одновременно в
реакцию встречного иммуноэлектрофореза /ВИЭФ/<*> /см. Приложение
N 1/.
---------------------------------
<*> - Преципитирующие и агглютинирующие менингококковые
группоспецифические антисыворотки производит Ставропольский научно
- исследовательский институт вакцин и сывороток МЗ СССР.
Агглютинирующие группоспецифические сыворотки производит также
Ленинградский научно - исследовательский институт вакцин и
сывороток МЗ СССР.
Оставшийся в пипетке материал используют для приготовления
двух мазков.
Мазки после фиксации окрашивают метиленовой синью или по Граму
в модификации Калины. Прямая микроскопия окрашенных мазков
спинномозговой жидкости в известной части случаев позволяет
установить наличие менингококков или других бактерий, вызывающих
гнойный менингит. Морфология менингококков описана выше. N.
influenxae видна в виде мелких грамотрицательных палочек,
окруженных еле заметной нежной капсулой. Пневмококки обычно имеют
вид ланцетовидных диплококков и коротких цепочек, образуют
капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся всеми анилиновыми
красками, при этом капсула остается неокрашенной.
Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в
виде предварительного ответа.
2-й день исследования. Независимо от результатов
бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр
чашек ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического
микроскопа - лупы МБС.
Возбудители, находящиеся в ликворе, вырастают в виде чистой
культуры. Наличие роста колоний на кровяном или "шоколадном" агаре
и отсутствие роста на простых средах указывает, что выросшая
культура относится к одной из патогенных групп микробов:
менингококкам, пневмококкам, стрептококкам, гемофилам и др.
Морфология менингококковых колоний на сывороточном агаре
описана выше. На кровяном агаре колонии нежные, слегка сероватого
или серовато - белого цвета, с блестящей поверхностью и ровными
краями, имеют маслянистую консистенцию. Менингококки не лизируют
эритроциты, поэтому среда их при росте не меняется. На
"шоколадном" агаре колонии менингококков имеют такую ме
морфологию, как на кровяном агаре, но меньшую величину.
Из выросших на поверхности агаровой среды колоний делают
мазки, красят по Граму в модификации Калины. На основании
микроскопии мазков возможна выдача предварительного ответа. Если в
мазках обнаружены грамотрицательные кокки, это дает право отнести
их к роду нейссерий и провести дифференциацию видов, учитывая, что
в редчайших случаях менингит может быть обусловлен непатогенными
нейссериями и B. catarrhalis.
Гемофилы на кровяных средах вырастают в виде очень мелких
прозрачных колоний. На "шоколадном" агаре они дают более пышный
рост. Колония легко снимаются со среды. В мазках из этих колонии,
окрашенных по Граму, видны мелкие короткие грамотрицательные
палочки с капсулой разной степени выраженности.
Колонии пневмококков мелкие, имеют более светлый по периферии,
а в центре зеленовато - серый цвет. Вокруг колонии часто
отмечается зона гемолиза, имеющая цвет от зеленоватого до зелено -
коричневого /тип альфа - гемолиза/, который возникает часто через
48 часов роста. По внешнему виду колонии пневмококков трудно
отличить от колоний зеленящего стрептококка. В мазках из этих
колоний пневмококки имеет овальную кокковидную форму и
располагаются парами. Колонии отсекают на сектор чашки с кровяным
иди сывороточным агаром.
Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим
одномоментный отсев на дифференциально - диагностические среды и
изучение культуры по ряду признаков /табл. 1, 2, 3/. Следует иметь
в виду, что при серогруппировании культур, снятых с кровяного
агара, возможна спонтанная агглютинация. В таких случаях необходим
пересев на некровяную среду и постановка реакции агглютинации в
пластине.
Оценка культурально - морфологических свойств, оксидазной и
каталазной активности позволяет дифференцировать пневмококки от
гемофилов и нейссерий. Наличие каталазной, уреазной и бета -
галактозидазной активности у культур дает основание
диагностировать гемофилы<*>.
--------------------------------
<*> - Подробная идентификация микробов рода Haemophilus
изложена в "Методических рекомендациях по выделению и
идентификации микробов рода Haemophilus, утвержденных МЗ СССР в
1979 г.
В случае обнаружения пневмококков, гемофилов и стафилококков
возможна выдача окончательного положительного ответа в тот же
день.
Таблица 2.
ТЕСТЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
ВЫДЕЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
-------------T------------T------------T-----------T-------------¬
¦ ¦ Окраска ¦ Реакция ¦ Реакция ¦ род ¦
¦ Морфология ¦ по Граму ¦ на оксидазу¦ на катала-¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ зу<*> ¦ ¦
+------------+------------+------------+-----------+-------------+
¦Палочки ¦ - ¦ - ¦ х ¦ гемофилы ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Кокки ¦ - ¦ + ¦ + ¦ нейссерии ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Кокки ¦ + ¦ - ¦ - ¦ пневмококки¦
L------------+------------+------------+-----------+--------------
--------------------------------
<*> - Используется 10 % перекись водорода.
Если число выросших колоний мало /1-2/, то их отсевают на
чашку с сывороточным или кровяным агаром для накопления микробной
массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки /на
3-й день от начала исследования/.
Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста
колоний, то делается высев на чашки с сывороточной и кровяной
средой из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким
агаром /среда обогащения/. При отрицательных результатах высев со
среды обогащения повторяют через 1-2 дня в течение 7 дней
инкубации в термостате.
При получении роста колоний их исследование проводят тем же
путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.
3-й день исследования. Чашки с суточной культурой, засеянные
из отдельных колоний, просматривают под МБС для оценки чистоты
выросшей культуры, готовят мазки, красят по Граму в модификации
Калины и просматривают. При обнаружении морфологически типичных
грамотрицательных кокков, проводят идентификацию /см. табл. 1/,
серогруппирование идентифицированных культур /см. Приложение N 1/,
а так же используют эту культуру для определения лекарственной
устойчивости.
Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день
исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного
положительного ответа.
4-й день исследования. Учитывают результата посевов о целью
дифференциации менингококка от непатогенных нейссерий и Br.
catarrhalis (если это не было сделано на 3-й сутки). Возможна
выдача положительного ответа. Культуру, выросшую yа сывороточном
агаре при температуре 37 град., можно использовать для
серологической идентификации менингококка в реакции агглютинации
или в реакции преципитации в агаре, а также для определения
лекарственной устойчивости (см. Приложение N 1).
При выделении чистой культуры менингококков только с помощью
метода обогащение окончательный положительный ответ выдается
позднее (в зависимости от длительности инкубации "обогащенных"
посевов в термостате).
II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ
При подозрении на менингококцемию или сепсис проводят
бактериологическое исследование крови. В качестве экспресс -
метода диагностики рекомендуется приготовление мазка "толстой
капли" из крови, взятой ив вены или пальца (см.Приложение N 1)<*>.
--------------------------------
<*> - Рекомендуется брать кровь у больного до введения
антибиотиков.
В препарате "толстой капли" менингококки имеют преимущественно
такую же морфологию, как в спинномозговой жидкости, но чаще
располагаются поодиночке, имеют более круглую форму. В мазке,
имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно - синий цвет
лейкоциты и между ними множество мелких, темно - синих,
располагающихся кучками, парно и по одному кокков. Результаты
бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде
предварительного ответа.
Несколько капель взятой стерильно из вены крови засевают
непосредственно на чашку с питательной средой, а затем на 0,1%
полужидкий агар в отношении 1:10, т.е. 1-2 мл крови можно посеять
в пробирку с 7-10 мл полужидкого агара или 5-10 мл крови засеять
во флакон с 50 мм среды. После суточной инкубации патогенный
материал высевают на сывороточный агар в чашку Петри.
При отрицательном результате рекомендуется инкубация в течение
недели с ежедневным или через день высевами<*>. Выделение и
идентификацию гемокультур проводят так же, как при исследовании
спинномозговой жидкости.
При сепсисе, вызванном гемофилами или пневмококками, бактерии
могут наводиться в крови. В этом случае следует проводить
бактериологическое исследование крови в соответствии с
особенностями возбудителя. Для выделения гемофилов исследуемую
кровь засевают на жидкую среду с кровью (см. Приложение N 1).
Таблица 3
ХАРАКТЕРИСТИКА БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГЕМОФИЛОВ
------------------T-------T-------T-----T--------T-------T-------¬
¦ Свойства ¦Реакция¦Реакция¦Реак-¦Бета - ¦Реакция¦Гемолиз¦
¦ ¦на ¦на ¦ция ¦галакто-¦на ¦ ¦
¦ Вид ¦ката- ¦окси- ¦нит- ¦зидазная¦уреазу ¦ ¦
¦ микроба ¦лазу ¦дазу ¦ратов¦актив- ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ность ¦ ¦ ¦
+-----------------+-------+-------+-----+--------+-------+-------+
¦H. influtnzae ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦
¦H. algyptins ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
¦H. parainfluenzae¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦
¦H. haemalyticus ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦
¦H. aphrephilus ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
L-----------------+-------+-------+-----+--------+-------+--------
III. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НОСОГЛОТОЧНОЙ
СЛИЗИ НА МЕНИНГОКОККИ
1-й день исследования. Исследуемый материал - слизь с задней
стенки носоглотки - берут натощак или через 3-4 часа после еды
стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке.
Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень
языка. Тампон вводят концом кверху за мягкое небо в носоглотку и
проводят 2-3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не
должен касаться зубов, слизистой щек и языка.
Материал может быть засеян на месте на чашку Петри с
питательной средой или взят тампоном, смоченными одной из
рекомендуемых транспортных сред и доставлен в лабораторию (см.
Приложение N 1). При посеве на чашку материал втирают на
поверхность небольшого участка - 1х2 см - среды всеми сторонами
тампона, затем этим же тампоном засевают штрихами (с отрывом) по
всей площади, отведенной для посева.
Рекомендуется использовать сывороточный агар с добавлением в
него ингибиторов, подавляющих рост грамположительных кокков. Для
этой цели используется ристомицин в оптимальной концентрация: 20
ед/мл среды. При такой концентрации ристомицина в среде
сохраняется рост штаммов менингококков, имеющих большой диапазон
чувствительности к этому антибиотику. Использование питательной
среды с ристомицином в указанной концентрации исключает
одновременный посев материалов на вторую чайку с сывороточной
средой без ристомицина. На одну чашку можно засеять две пробы.
Вместо ристомицина в качестве ингибитора грамположительных
кокков можно использовать линкомицин (5 мкг/мл среды). В этом
случае на одной чашке также можно посеять две пробы. Однако
встречаются отдельные штаммы менингококка, более чувствительные к
линкомицину, поэтому те же пробы одновременно засевают на половину
чашки с сывороточным агаром без линкомицина.
Засеянные чашки доставляют в лабораторию, тщательно защищая их
от охлаждения, в зимнее время применяя грелки (35-40 град.), и
немедленно помещают в термостат при температуре 37 град.
Тампоны с исследуемым материалов, погруженные в транспортную
среду, доставляют в лабораторию, также тщательно защищенными от
охлаждения. Тампоны в 0,1% полужидком агаре помещают в термостат
для подращивания флоры. Смоченные тампоны или тампоны в
транспортной бульонной среде засевают на чашку с сывороточным
агаром, лишенным ингибитора, без предварительного подращивания
(см. Приложение N 1). Посев делают тампоном, как описано выше.
Засеянные чашки помещают в термостат.
2-й день исследования. Просматривают чашей, засеянные
накануне, визуально и под лупой - микроскопом МБС, подозрительные
колонии отсевают на секторы чашки с сывороточным агаром (не менее
3-5 колоний). Внешний вид колоний менингококка описан выше. На
средах с ингибиторами вырастают только грамотрицательные бактерии,
преимущественно представители рода нейссерий. При отсутствии роста
в чашках с антибиотиками проводят повторный просмотр их через
40-48 часов после посева.
Колонии менингококков и Вг. catarrhalis бесцветны. Колонии
пигментообразующих нейссерий дифференцируются благодаря желтоватой
окраске. Пигмент может быть слабо выражен и выявляется при
последующем субкультивировании на увлажненной среде.
В эти же сутки делают высев из полужидкой (0,1%) транспортной
среды на чашку с сывороточным агаром без ингибитора.
3-й день исследования. Проводят микроскопирование чистой
культуры, выросшей на сывороточном агаре. В первых генерациях для
менингококков характерен полиморфизм и вариабельность окраски, что
не наблюдается у непатогенных нейссерий.
Культуры, колонии которых имеют желтый пигмент различной
интенсивности, а также характеризующиеся "сухим" ростом,
отбрасывают.
Следует иметь в виду, что на сывороточном агаре колонии
менингококков могут выглядеть желтоватыми из - за оттенка среды.
Поэтому для обнаружения пигмента их необходимо просматривать при
дневном освещении. О пигментообразовании можно судить и по цвету
культуры, снятой со среды и находящейся на бактериологической
петле. Следует использовать также пересевы на влажный агар.
Для дальнейшего исследования на менингококк оставляют только
непигментированные культуры, дающие нежный влажный рост. Из них
готовят мазки, окрашенные по Граму в модификации Калины. После
микроскопии из этих культур делают посев на сывороточный и
бессывороточный агар (при температуре 37 град.), среды с
углеводами: лактозой, глюкозой, мальтозой, сахарозой, фруктозой,
на 5% желчный агар, на сывороточный агар с 5% сахарозы для
определения продукции полисахарида. Многие непатогенные нейссерии
продуцируют крахмалоподобное вещество, что проявляется в изменении
цвета бактериальной массы на бурый при нанесении 1 капли водного
раствора Люголя на поверхность выросшей культуры. Для
менингококков эта реакция отрицательна, цвет не меняется (см.
Приложение N 1).
Если рост культуры из отсеянных колоний достаточно обильный,
то в эти сутки ставят реакцию агглютинации с группоспецифическими
сыворотками на стекле, а также готовят взвесь для постановки
реакции агглютинации капельным методом, который позволяет снять в
некоторых случаях спонтанную агглютинацию и оценить
группоспецифическую принадлежность штамма по интенсивности реакции
при наличии полиагглютинабельности в реакции агглютинации на
стекле (см. Приложение N 1).
На этом этапе можно поставить остальные тесты, представленные
в таблицах и рекомендованные для идентификации всех видов
нейссерий. В посеве на чашке, сделанном с транспортной полужидкой
среды, выявляется в основном рост культур нейссерий, идентификацию
которых проводят в соответствии с изложенным ходом
бактериологического исследования.
4-й день исследования. Просматривают посевы, сделанные в
предыдущий день. Учитывают результаты роста на бессывороточном и
желчном агаре (при температуре 37 град.), сахаролитическую
активность, ставят реакцию с водным раствором Люголя на продукцию
полисахарида, проводят окончательную серологическую идентификацию
менингококков по реакции агглютинации или реакции преципитации в
агаре.
В этот день выдают окончательный положительный или
отрицательный ответ. Результаты бактериологического исследования с
полужидкой транспортной среды соответственно будут получены на
сутки позднее.
IV. ИССЛЕДОВАНИЕ ТРУПНОГО МАТЕРИАЛА
В связи со слабой жизнеспособностью менингококков
бактериологическое исследование трупного материала не имеет
смысла. Гной с мозговых оболочек, из кожных поражений и т.п.,
взятый во время вскрытия, микроскопируют.
V. СОХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА
ВЫДЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР
Идентифицированные культуры уничтожают или передают по
требованию в специализированные лаборатории НИИ и опорные базы.
При необходимости дополнительного или повторного исследования, а
также для методических целей, свежевыдеденные штаммы сохраняют.
В течение 1 месяца и более культуру можно сохранить в
полужидком сывороточном агаре или посеянной уколом в столбик
сывороточного агара. Выросшую через сутки культуру в столбике
затем заливают стерильным вазелиновым маслом /1,5-2,0 мл/.
Столбики эасеянных культур удобны при транспортировке. Культуры
следует хранить при комнатной температуре /не ниже + 14 град./ или
в термостате и пересевать 1 раз в 10 дней.
При обычном культивировании Н. influenzae быстро гибнет.
Жизнеспособность гемофилов можно продлить до 1 месяца, для чего
делают обильный посев на скошенный "шоколадный" агар и после
суточной инкубации создают полную герметизацию /можно с помощью
парафина/. Такую культуру для пересева используют только
однократно. Дегерметизация приводит к гибели субкультуры. Для
сохранения культуры пневмококков ее засевают на скошенный кровяной
агар в пробирке. В таком состоянии она сохраняет жизнеспособность
в течение 4-6 дней при комнатное температуре или в холодильнике
при температуре 4 град. Для получения свежей культуры с
поверхности засеянного агара делают соскоб петлей и пересевают на
свежую среду такого же состава, ставят на сутки в термостат при
температуре 37 град. и выращивают в атмосфере с повышенным
содержанием СО2.
В таких же условиях инкубируют и пробирку с исходным посевом,
хранившимся в течение нескольких дней при комнатной температуре
или температуре холодильника.
VI. СРОКИ ВЫДАЧИ ОТВЕТОВ И ИХ ФОРМУЛИРОВКА
1. При бактериологическом исследования ликвора сроки выдачи и
формулировка ответов производится следующим образом;
на 1-й день на основании прямой бактериоскопии ликвора дают
предварительный ответ, который в зависимости от результата
формулируют в трех вариантах:
а/. при наличии в мазках большого числа морфологически
типичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости при прямой
бактериоскопии обнаружены грамотрицательные кокки /или
грамположительные кокки/, сходные по морфологии с менингококками
/или пневмококками т.д./. Исследование продолжается".
б/. при наличии в мазках единичных бактерий пишут: "В
спинномозговой жидкости при прямой бактериоскопии обнаружены
единичные /или парные/ клетки кокков /или палочки/";
в/. при отсутствии каких - либо бактериальных клеток пишут: "В
спинномозговой жидкости при прямой бактериоскопии бактерий не
обнаружено."
На основания реакции встречного иммуноэлектрофореза /BИЭФ/
ликвора дают ответ, который в зависимости от результата
формулируют в трех вариантах:
а/. при наличии линий преципитации с одной из
группоспецифических автименингококковых сывороток пишут: "В
спинномозговой жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза
/ВИЭФ/ выявлен специфический антиген серогруппы А /или другой
серогруппы/";
б/. при наличии линий преципитации с несколькими
группоспецифическими антименингококковыми сыворотками пишут: "В
спинномозговой жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза
/ВИЭФ/ выявлены менингококковые антигены;
в/. при отсутствии линий преципитации пишут: " В
спинномозговой жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза
/ВИЭФ/ специфические менингококковые антигены не выявлены".
На 2-й день выдают ответ также предварительного характера,
который в зависимости от результатов бактериологического
исследования формулируют следующим образом:
а) при росте бактерий по морфологическим и культуральным
свойствам, типичном для нейссерий и других родов, пишут: "При
прямом посеве спинномозговой жидкости подучен рост нейссерий (или
стафилококка, стрептококка, пневмококка, грамотрицательной палочки
и др.). Изучение культуры продолжается";
б) при отсутствии роста пишут: "При прямом высеве
спинномозговой жидкости роста бактерий не обнаружено. Исследование
продолжается".
На 3-й день на основании культурально - биохимических свойств
бактерий, отсеянных с чашки на 2-й день, выдают окончательный
ответ:
"Из спинномозговой жидкости выделена культура менингококка
серогруппы А, В и т.д. (или негруппируемая)". В редчайших случаях
Вг. catarrhalis или непатогенные нейссерии.
В этот же день может быть дан предварительный ответ о росте
(или его отсутствии) бактерий в результате высева из среды
обогащения. Формулировка та же, что и при оценке результатов
прямого посева с чашки. В этот же день выдают окончательный
положительный ответ на гемофилы м пневмококки, который
формулируют: "Из спинномозговой жидкости выделена культура Н.
influenzae или Str. puenmonie".
На 4-й день может быть выдан окончательный положительный ответ
о видовой принадлежности нейссерий, выросших при прямом посеве.
На этом же этапе, как и в следующие дни (вплоть до 7-8-го
дня), может быть выдан окончательный положительный ответ,
полученный в результате высева из среды обогащения. Формулировка
та же (см. 3-й день).
Окончательный отрицательный ответ выдают не ранее 7-го дня,
когда при последнем высеве из среды обогащения (на 7-й день ее
инкубации) не обнаруживают роста бактерий. Его формулировка: "При
инкубации спинномозговой жидкости на среде обогащения в течение 7
дней бактерий выделить не удалось".
II. При бактериологическом исследовании крови сроки выдачи и
формулировка ответов производится следующим образом:
на 1-й день на основании прямой бактериоскопии крови в
препарате "толстой капли" дают ответ, который в зависимости от
результата формулируют в трех вариантах:
а/, при наличии в мазках большого числа морфологически
типичных бактерий пишут: "В крови при прямой бактериоскопии
обнаружены бактерии, морфологически сходные с менингококками /или
стафилококками пневмококками и т.д./;
б/. при наличии в мазках единичных бактерий пишут: "В крови
при прямой бактериоскопии обнаружены единичные /или парные/ клетки
кокков /или палочек/";
в/. при отсутствии каких - либо бактериальных клеток пишут: "В
крови при прямой бактериоскопии бактерий не обнаружено".
При бактериологическом исследовании крови выдают только
окончательные ответы. Положительные ответы возможны не ранее 2-го
и не позднее 8-го дня с момента посева. Формулировка
положительного ответа:" Из крови выделены менингококки серогруппы
........ или негруппируемые /или стафилококки, пневмококки, H.
influenzae и др./"
Срок выдачи отрицательного ответа 8-9-й день. Его
формулировка: "Из крови культура бактерий не выделена".
При бактериологическом исследовании слизи из носоглотки выдают
только окончательные ответы. Сроки выдачи и формулировки
следующие:
на 4-й день при выделении культуры менингококка выдают
положительный ответ: " В носоглоточной слизи обнаружены
менингококки серогруппы .. . . .... / или негруппируемые /.
В случаях добавочного отсева колоний с чашек, а также при
использовании транспортной полужидкой среды сроки выдачи ответа
соответственно отодвигаются на сутки.
При отсутствии роста менингококков в посевах выдают
отрицательный ответ: "В носоглоточной слизи менингококки не
обнаружены".
Приложение N 1
РЕЦЕПТЫ КРАСОК
1) Приготовление водного раствора метиленовой синей (для
окраски мазков, ликвора и "толстой" капли).
Водный раствор метиленовой синей готовят 1% или 1:300 на
холодной дистиллированной воде.
2) Окраска по Граму в кодификации Калины препаратов из ликвора
и культур.
1. Приготовление растворов
а) 0,5% спиртовой раствор бриллиантовой зелени:
бриллиантовой зелени 0,05
спирта этилового чистого 10,0.
Хранить во флаконе с резиновой пробкой.
а) Основной реактив:
0,5% - спиртовой раствор йодистого калия - 96 мл
5% спиртовой раствор основного фуксина - 2 мл
5% спиртовой раствор йода - 2 мл
0,5% спиртовой раствор йодистого калия готовят при
подогревании в водяной бане. После полного растворения навески
йодистого калия в спирту раствор соединяют с раствором фуксина и
йода. Полученную смесь хранят во флаконе из желтого стекла с
притертой или резиновой пробкой.
в) Раствор спирта:
спирта этилового 96 град. - 30 мл
дистиллированной воды - 70 мл
г) Водный раствор фуксина:
основной фуксин Циля - 1 мл
дистиллированной воды - 9 мл
Раствор ежедневно обновлять.
2. Окраска мазка
На обезжиренное стекло наносят каплю воды. В ней суспензируют
культуру и туда же вносят петлей каплю раствора бриллиантовой
зелени. После просыхания препарат фиксируют над пламенем. Затеи на
препарат наливают основной краситель на 1,5-2 минуты, после чего
краску сливают и стекло в наклонном положении промывают водой.
Далее препарат в наклонном положения промывают в спирте /до
отхождения облачков краски/ и немедленно отмывают водой. Затем
производят докрашивание препарата водным раствором фуксина в
течение 2 минут, окончательную промывку водой и подсушивание. При
микроскопировании грамотрицательные бактерии выглядят
яркорозовыми, грамположительные - зеленовато - черными или темно -
фиолетовыми. Желательно для контроля на каждом стекле делать мазок
культур стафилококков или кишечной палочки.
3. Приготовление и окрашивание "толстой" капли крови
На середину предметного стекла пипеткой наносят каплю крови
или прикладывают стекло непосредственно к капле, выступающей из
пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают стеклянной палочкой
так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине
копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до
подсыхания крови. Кровь в "толстой" капле распределяется
неравномерно, образуя неровные края. Окраску мазка производят
водным раствором метиленовой синей в течение 2-3 минут, без
предварительной фиксации. Лишнюю краску осторожно смыть слабой
струей водопроводной воды. Подсушить мазок на воздухе. Смотреть
под иммерсией.
В мазке, имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно
- синий цвет ядра лейкоцитов и между ними мелкие темно - синие
располагающиеся по одному, парами или пучками кокки с небольшим
бесцветный ореолом.
МЕТОД СОЗДАНИЯ ПОВЫШЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ УГЛЕКИСЛОТЫ
В ЧАШКАХ ПЕТРИ
/рекомендуется при первичном выделения менингококков
из ликвора, крови и получения биомассы/
Реактивы:
1. 10% раствор пирогалловой кислоты - /В/.
2. 20% раствор питьевой соды.
3. Стерильные листки фильтровальной бумаги по диаметру крышки
чашки Петри.
4. Стерильные листки фильтровальной бумаги большего диаметра,
чем крышка чашки Петри.
В крышку стерильной чашки Петри положить листок фильтровальной
бумаги, быстро смочить его 1,5 - 2,0 мл 10% раствора пирогаллола.
Покрыть вторым листком, который быстро смочить 1,5-2,0 мл 20%
раствора питьевое соды. Эти листки покрыть листком большего
размера. Крышкой с листками плотно закрыть чашку с посевом. Посев
поместить в термостат крышкой вниз.
Для создания повышенного СО2 можно также использовать любой
сосуд /свечной сосуд/ с притертой крышкой, например, эксикатор.
Засеянные чашки помещают внутрь сосуда вверх дном, там же
укрепляют зажженную свечу высотой 3-4 см и закрывают крышкой,
которой может служить и простое большое стекло. К моменту
затухания свечи в сосуде создается повышенная концентрация СО2
/7-10%/. После этого сосуд с посевами помещают в термостат.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
1. Сывороточный агар
В качестве основы используют 1,2-1,5% агар /рЕ-7,4/,
приготовленный на бульоне из рыбного гидролизата, бульоне из
перевара Хоттингера /аминный азот в бульоне 150-160 мг/мл /или на
сухом питательном агаре специального назначения. К 80 мл
расплавленного и остуженного до температуры 50 град. агара
добавляют 20 мл инактивированного при температуре 56 град. в
течение 30 минут сыворотки, консервированной хлороформом, или без
консерванта /при инактивировании сыворотки консервант
улетучивается/. После перемешивания среду разливают в чашки. Среда
годна к употреблению только в течение 48 часов при хранении ее в
холодильнике. Перед посевом чашки, хранившиеся в холодильнике,
должны быть подсушены и подогреты до температуры 37 град.
2. Сывороточный агар с ристомицином<*>
К 80 мл расплавленного и остуженного агара /такого же, как и
для приготовления сывороточного агара/ добавляют 20 мл сыворотки и
0,1 мл раствора ристомицина, содержащего 2000 ед/мл среды
/конечная концентрация антибиотика 20 ед/мл питательной среды/.
--------------------------------
<*> - приобретение ристомицина и линкомицина осуществляется в
установленном порядке.
В связи с испытываемыми трудностями в снабжении ристомицином
рекомендуется простой метод, позволяющий экономно расходовать
антибиотик. Препарат разводят стерильным физиологическим раствором
до рабочей концентрации и затем разливает по стерильным
пенициллиновым флаконам или центрифужным пробиркам под ватными или
резиновыми пробками и замораживают в морозильной камере.
Количество рабочего раствора во флаконах или пробирках зависит от
потребности лаборатории.
Рабочий раствор сохраняют в морозильной камере до момента
использования. В случае необходимости раствор оттаивают и
добавляют в среду. Например, во флакон, содержащий 100 мг /10000
ед/ ристомицина, вносят 5 мл стерильного физиологического
раствора. Полученное разведение препарата является рабочим. Его
удобно разлить по 0,5 мл и заморозить. В таком состоянии препарат
может храниться несколько месяцев.
3. Сывороточная среда с линкомицином.
К 80 мл расплавленного и остуженного агара добавляют 20 мл
сыворотки и 0,5 мл раствора линкомицина в концентрации 1000
мкг/мл.
Конечная концентрация антибиотика в среде - 5 мкг/мл
питательной среды. Раствор линкомицина можно хранить при
температуре +4 град. в течение 6 месяцев.
4. Полужидкий агар для хранения культур и обогащения ликвора
К 4 мл 0,1% полужидкого питательного агара /рН=7,4/,
приготовленного на бульоне из перевара Хоттингера или рыбного
гидролизата, добавляет 1 мл предварительно инактивированной
сыворотки c консервантом или без него. Пробирки ставят на сутки в
термостат для контроля. Среды сохраняют в холодильнике и перед
посевом подогревают в термостате. Эту же среду используют для
обогащения спинномозговой жидкости и посева крови. В этих случаях
внесение сыворотки нецелесообразно.
Пересев культуры производят раз в 7-10 дней. Высевы со среды
обогащения через 2-3 суток.
5. Плотный агар для хранения культур под вазелином
Сывороточный агар, используемый для посева на чашках,
разливают по пробиркам столбиком. Культуру засевают уколом и
ставят в термостат на сутки. При появлении роста по ходу укола и в
виде бляшки на поверхности среды в пробирку заливают 1,5-2,0 мл
стерильного вазелинового масла. Культуры под вазелином можно
хранить без пересевов до 3 месяцев /в термостате или при комнатной
температуре/.
6. Кровяной агар
Кровяной агар готовят на тех же питательных основах, что и
сывороточный агар. К расплавленному и охлажденному до температуры
50 град. агару добавляют 5-7% дефибринированной бараньей или
кроличьей крови /только не человека/, тщательно перемешивают,
избегая образования пены и пузырьков, и разливают в чашки Петри.
7. "Шоколадный" агар /кипяченый/
Для приготовления этой среды может быть использована кровь
любого животного или человека.
Питательный агар с рН - 7,3-7,4 растапливают, добавляют 5%
цельной или дефибринированной крови и ставят в кипящую воду на 3
минуты. Затем вновь добавляют 5% крови, тщательно перемешивают и
ставят в кипящую баню на 3 минуты. После этого агар взбалтывают и
разливают по чашкам Петри или пробиркам для приготовления косяков.
8. "Шоколадный" агар /гретый/
Для приготовления этой среды может быть использована только
кровь барана, кролика или лошади, так как кровь других животных
может содержать У - антифактор, который необходимо инактивировать
кипячением.
Питательный агар с рН - 7,3-7,4 растапливают и охлаждают до
температуры 60 град. Стерильно добавляют 5% цельной или
дефибринированвой крови. Тщательно перемешивают и ставят на 2-3
минуты в водяную баню при температуре 60 град. После этого
вторично добавляют 5% крови и вновь ставят в водяную баню при
температуре 60 град. на 2-3 минуты. Затем агар тщательно
взбалтывают и разливают по пробиркам и чашам Петри. Среду хранят
не более 2 недель.
Приготовление и стерилизация тампонов
Для взятия носоглоточной слизи используют ватные тампоны,
укрепленные на металлической проволоке. Лучше всего применять
проволоку из малоокисляемого металла /алюминия/ диаметром 2-3 мм.
Проволоку изгибают под углом 135 град. на расстоянии 1-2 см от
конца, на который накручен ватный тампон; 5-10 таких проволок
завертывают в бумагу и стерилизуют сухим паром или в автоклаве.
Можно использовать также стерильные ватные тампоны на проволоках,
вмонтированных в пробирку.
Непосредственно перед взятием материала, перед извлечением из
пробирки проволоку на расстоянии 1-2 см от конца изгибают под
углом 135 град. путем надавливания на край пробирки /или заранее,
перед стерилизацией/.
ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДЫ
Приготовление смоченных тампонов
Бульон готовят на рыбно - гидролизатной пасте с добавлением
20% сыворотки животных и ристомицина из расчета 20 ед/мл среды.
Используют ватные тампоны на алюминиевых стержнях, вмонтированные
в пробирку. Перед выездом за материалом тампоны пропитывают
бульоном из расчета 10-12 тампонов в 5 мл бульона, соблюдая
стерильность. Тампоны к месту забора материала и обратно в
лабораторию доставляют, предохраняя их от холода. Длительность
транспортировки материала с момента взятия до посева в питательную
среду не должна превышать 3-4 часов.
Приготовление полужидкого
питательного агара
К 80 ил полужидкого питательного агара на бульоне из перевара
Хоттингера (рН = 7,4-7,6) или из рыбного гидролизата (пасты)
Дагестанского института питательных сред добавляют 20 мл лошадиной
сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота и 0,1 мл раствора
ристомицина, содержащего 20 000 ед/мл (конечная концентрация 20
ед/мл питательной среды). Среду разливают в пробирки по 8 мл,
выдерживают 2 суток в термостате для контроля и затем хранят в
холодильнике.
При длительном хранении среды во избежание ее высыхания
пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками. Перед
использованием пробирки со средой подогревают в термостате или при
комнатной температуре, но в темном месте.
В случае использования сухого питательного агара среду готовят
из расчета 300 мг сухого питательного агара на 100 мл 1% пептонной
воды или мясо - пептонного бульона (рН = 7,4-7,6), затем
стерилизуют в автоклаве при температуре 120 град. в течение 30
минут.
Перед употреблением в среду вносят те же ингредиенты и в тех
же соотношениях, что и в среду, приготовленную на бульоне
Хоттингера. Среда с аспарагином в качестве транспортной среди не
пригодна.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО - ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ
1. 5% желчный агар
В необходимое количество расплавленного и охлажденного
описанного выше агара добавляют 5% фильтрованной через стерильную
вату желчи, разливают по флаконам и стерилизуют текучим паром 3
дня подряд по 30 минут или однократно при температуре 110 град. в
течение 30 минут.
Перед разливом в чашки Петри в каждый флакон с растопленным и
охлажденным до температуры 50 град. желчным агаром добавляют 20%
анактивированной в течение 30 минут лошадиной сыворотки.
2. Среды с углеводами
А. Плотные среды
Готовят на той же питательной основе, что и предыдущие. К 75
мл агаровой основы добавляют 0,9 г одного из углеводов (глюкоза,
мальтоза, сахароза, лактоза, фруктоза) и 3,9 мл раствора
индикатора фенолового красного. Агар стерилизуют текучим паром 3
дня по 30 минут или однократно в течение 30 минут при 0,5 атм.
Перед употреблением среду растапливают в водяной бане,
охлаждают до температуры 48-50 град., добавляют 20 мл
инактивированной нормальной сыворотки и разливают в чашки. На 1
чашку можно посеять не более 6 культур. Сектор с посевом должен
быть узким, у основания не более 1 см, а расстояние между ними не
менее 2-3 см.
Таким образом, каждую культуру засевают на 5 часов с
различными углеводами. Учет результатов производят через 24 часа
инкубации в термостате. При разложении какого - либо углевода с
образованием кислоты красный цвет среды в секторе посева меняется
на ярко - желтый.
Приготовление раствора индикатора
фенолового красного (фенол - рот)
Смешивают 0,4 г порошка фенол - рот с 16 мл 0,1 NаОН и
выдерживают в термостате до полного растворения при частичном
встряхивании. Затем раствор доводят до объема 200 мл
дистиллированной водой, разливают во флаконы и стерилизуют при 1
атм. в течение 20 минут.
Б. Полужидкие среды Хью - Лейфсона
Эти среды позволяют уловить рН среды даже при слабом окислении
углеводов, что достигается в результате снижения процесса
дезаминирования аминокислот питательных сред.
Состав среды:
- углевод 1%, пептон 0,2%,
- NaCl 0,5%, K2HPO4 0,3%
- агар 0,3%, индикатор Андреде 2%
- вода дистиллированная 100 мл
Разлить в пробирки по 0,5 мл и стерилизовать текучим паром 3
дня подряд по 20 минут.
О разложении углеводов на среде Хью - Лейфсона судят по
появлению розового окрашивания через 18-24 часа со времени посева,
иногда ферментация бывает замедленной и появляется через 48 часов.
В. Жидкие среды
К 7 мл стерильного бульона стерильно добавляют 8 мл лошадиной
или бычьей сыворотки, 0,15 мл раствора бром - тимол - синего и
0,85 мл 4% раствора одного из углеводов. Среда имеет салатно -
зеленый цвет.
Среды могут сохраняться в холодильнике в течение месяца. В
день постановки теста среды разливают в стерильные
агглютинационные пробирки по 0,3-0,4 мл. Испытываемую культуру
засевают "полной" петлей до видимого помутнения среды. Одну
пробирку с каждым углеводом оставляют незасеянной и используют для
контроля.
Пробирки помещают в термостат на 1 сутки. При сбраживании
углевода среда желтеет.
На водопроводной воде готовят 4% растворы углеводов, разливают
по 5,0 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при температуре 110
град. в течение 15 минут. После стерилизации к ним добавляют
стерильный 0,1% раствор NаОН из расчета по 0,25 мл на 5 мл 4%
раствора глюкозы, сахарозы или лактозы и по 0,8 мл на 5,0 мл 4%
раствора мальтозы и левулезы (фруктозы).
Для приготовления 0,4% водного раствора бром - тимолового
синего берут 0,1 г этого красителя, заливают 3,2 мл 0,2% раствора
NаОН, растирают стеклянной палочкой и оставляют в термостате на 1
сутки до полного растворения; затем к раствору доливают
дистиллированную воду до объема 25,0 мл. Раствор хранят под
резиновой пробкой.
При подозрении на загрязнение из пробирки с разложившимся
углеводом в жидкой или полужидкой среде делают высев на сектор
(1/4) часки сывороточного агара. В случае примеси посторонней
флоры испытываемая культура подлежит очистке и повторной проверке.
3. Определение продукции полисахаридов
на агаре с 5% сахарозы
К обычно употребляемой плотной среде для культивирования
менингококков добавляют 5% сахарозы, среду разливают в чашки
Петри, добавив 20% сыворотки. Производят густой высев культуры
петлей cектором, на одну чашку можно посеять несколько штаммов.
Через 48 часов инкубации в термостате на поверхность выросшей
культуры наносят 1 каплю водного раствора Люголя, обычно
употребляемого при окрашивании мазков по Граму. Реакция считается
положительной при образовании бурого окрашивания выросшей
культуры.
4. Серогруппирование менингококковых культур
А. Реакция агглютинации на стекле
с менингококковой культурой
При использовании диагностических менингококковых сывороток,
изготовленных Ленинградским научно - исследовательским институтом
вакцин и сывороток МЗ СССР, каждую ампулу разводят 1 мл
физиологического раствора.
При использовании диагностических менингококковых сывороток,
изготовленных Ставропольским научно - исследовательским институтом
вакцин и сывороток МЗ СССР, каждую ампулу разводят сначала 1 мл
физиологического раствора, а затем дополнительно еще раз
физиологическим раствором из расчета 1:10.
На стекло в ряд наносят отдельными пипетками капли
диагностических сывороток различных серогрупп и каплю
физиологического раствора (для контроля культуры на спонтанную
агглютинацию). Затем бактериологической петлей после ее прожигания
и охлаждения берут испытываемую культуру, растирают рядом с каждой
петлей и соединяют культуру и сыворотку. Покачивая стекло,
наблюдают наступающую при увеличении в вогнутом зеркале микроскопа
реакцию.
РА протекает и учитывается в течение 1-3 минут. Учет
результатов РА производят по 4 - плюсовой шкале:
++++ - полная агглютинация, полное просветление реакционной
смеси, резко положительная;
+++ - хорошо выраженная агглютинация, явное просветление
реакционной смеси, положительная;
++ - неполная агглютинация с заметным просветлением
реакционной смеси;
+ - еле заметная агглютинация без просветления реакционной
смеси - практически отрицательная,
- отсутствие агглютинации - отрицательная.
В случае перекрестных реакций агглютинации с несколькими
сыворотками или аутоагглютинации ставят реакцию агглютинации
капельным методом.
Б. Реакция агглютинации с менингококковой
культурой капельным методом
Реакцию агглютинации с исследуемым штаммом менингококков
ставят на полистироловых пластинах. Сыворотки разводят вдвое (или
согласно наставлению) и по 1 капле (0,025 мл) вносят в каждую
лунку по вертикали. Число лунок соответствует количеству
исследуемых сывороток. Отдельно в лунке готовят взвесь культур в
физиологическом растворе. Необходимая густота взвеси
обеспечивается сливным ростом микробных клеток на 1/8-1/10 части
чашки Петри. Запаянной изогнутой пастеровской пипеткой снимают
бактериальную массу и тщательно эмульгируют в 2 каплях
физиологического раствора, внесенных в лунку. Затем, для получения
рабочей густоты к микробной взвеси добавляют еще 0,5 мл (18-20
капель) физиологического раствора. Эту рабочую взвесь (лучше
верхний слой этой взвеси) разносят по 1 капле в горизонтальные
лунки по числу имеющегося набора агглютинирующихся сывороток.
Пластины встряхивают в течение 1 минуты руками или в шуттеле.
Перед учетом реакции агглютинации в каждую лунку добавляют 1 мл
физиологического раствора, что обеспечивает четкие результаты.
Специфическая реакция выявляется и учитывается в течение 0,5-8
минут. Более поздний учет не исключает наличия реакции за счет
перекрестнореагирующих антигенов.
Контролем служит лунка, в которой готовили исходную взвесь
бактерий в физиологическом растворе.
Заключение о принадлежности культуры к той или иной серогруппе
производят на основания положительной реакции агглютинации с
соответствующей сывороткой по 4 - плюсовой шкале (при отсутствии
агглютинации в физиологическом растворе).
При наличии реакции агглютинации с несколькими сыворотками
серогруппу микробов определяют по интенсивности реакции с
какой - нибудь из сывороток. Например, в случае реакция на 4+ с
антисывороткой к группе А и 2+ реакцией с антисывороткой к группе
С, культуру относят к серогруппе А. В случае реакции с несколькими
сыворотками, одинаковой по интенсивности, культуру определяет как
полиагглютинабельную. При спонтанной агглютинации культуры в
физиологическом растворе серогруппу не учитывают.
Реакция микропреципитации в агаре
с менингококковой культурой<*>
Реакцию микропреципитации в агаре ставят в чашках Петри, на
стеклянных пластинках или предметных стеклах. Для этого используют
1% агар /фирмы Дифко или Дальневосточного сорта/, приготовленный
на физиологическом растворе. Основное требование к агару -
максимальная прозрачность.
--------------------------------
<*> - см. наставления по применению сыворотки диагностической
менингококковой, группоспецифической, преципитирующей, жидкой
/Ставропольский научно - исследовательский институт вакцин и
сывороток МЗ СССР/, прилагаемые к упаковке сывороток.
В чашку Петри и на стеклянную пластинку размером 9х12 см
наливают 20 мл, а на предметное стекло - 5 мл расплавленного 1%
агара слоем в 3 мм. В застывшем агаре с помощью металлических
трубок просекают отверстия /лунки/ диаметром 3 мм, из которых
агаровые пробки удаляют путем отсоса этой же трубкой или острием
иглы. Расстояние между центрами лунок 0,5 см.
Лунки в агаре располагают следующим образом: в центральную
лунку пастеровской пипеткой наливают сыворотку, в периферические -
прогретые при температуре 100 град. в течение 30 минут взвеси
испытываемых культур.
Каждую культуру испытывают в двух опытах одновременно.
Микробную кипяченую взвесь можно хранить в холодильнике в течение
2 недель. Для реакции микропреципитации используют цельные
сыворотки.
Концентрация испытываемой суточной культуры менингококка,
выращенной на 20% сывороточном агаре Хоттингера, должна составлять
50-60 единиц, т.е. быть в 5-6 раз гуще оптического стандарта
мутности в 10 единиц. Чашки Петри или стеклянные пластинки с
лунками, заполненными сывороткой и антигенами, помещают во влажную
камеру /эксикатор с водой/ на 24-48 часов при температуре 20-22
град.. По окончании срока учитывают реакцию. Реакция проявляется
только со штаммами менингококков гомологичной серогруппы в виде
1-2 линий преципитации.
I. Метод встречного иммуноэлектрофореза
(ВИЭФ)
У больного гнойным менингитом берут спинномозговую жидкость
желательно до применения химиотерапии. Спинномозговую жидкость
центрифугируют. Осадок спинномозговой жидкости исследуют на
присутствие специфического полисахаридного антигена. Для этого
используют аппарат для иммуноэлектрофореза (ПЭФ-3) или любой
другой марки. В аппарат заливают веронал - мединаловый буфер,
содержащий в 1 л дистиллированной воды 8,76 г мединала и 1,98 г
веронала, ионная сила его составляет, 0,05. Использует агар фирмы
"Дифко" или агар других сортов, приготовленных на этом же буфере.
Для этого 1-1,2% агар, растопленный и остуженный до 70 град.,
наносят слоем в 3 мм на поверхность стеклянной пластинки, размер
которой соответствует размеру рабочей поверхности аппарата (лучше
9 х 12 см). После застывания агара пробойником или металлической
трубкой, диаметр которой равен 3 мм, высекают 2 параллельных ряда
отверстий на расстоянии 8 мм друг от друга.
Ряды располагают перпендикулярно к направлению силы тока.
Преципитирущие менингококковые сыворотки разных серогрупп
вносят в лунки, расположенные близко к вводу (+), а осадок
спинномозговой жидкости к катоду (-). Сыворотку каждой серогруппы
вносят в отдельную лунку.
Приготовленную пластинку помещают в аппарат для
иммуноэлектрофореза на 40-45 минут при силе тока 28-30 А. Аппарат
работает при комнатной температуре. Результат ВИЭФ считается
положительным при наличии 1-2 полос преципитации, расположенных
между лункой со спинномозговой жидкостью. Учет результатов ВИЭФ
можно производить при подсвечивании стекла настольной лампой.
Таким образом, метод ВИЭФ позволяет не только определить
наличие специфического антигена в ликворе больного, но и
установить его серогрупповую принадлежность.
Приготовление агара для постановки реакции
преципитации и ВИЭФ
Из дальневосточных сортов агар - агара готовят 2% взвесь на
дистиллированной воде. Растопленный агар разливают в ванночки
слоем в 1 см и в застывшем состоянии нарезают квадраты диаметром
1х1 см. Затем его промывают проточной водопроводной водой с
течение 24-48 часов, затем сутки - дистиллированной, которая
заменяется 3-4 раза. Отмытый агар отжимают от воды, разогревают в
кипящей водяной бане, фильтрует через бумажный фильтр и добавляют
дистиллированную воду до первоначального объема. К горячему
полуфабрикату добавляют NaCl до 1,7% в конечной концентрации и
кипятят в водяной бане до полной гомогенизации смеси. К остывшему
до 60 град. агару добавляют мертиолят из расчета 1:10000, после
чего производят разлив в чистую посуду порциями по 50-100 мл во
флаконы или по 10 мл в пробирку.
При наличии агара фирмы "Дифко" готовят 1% его раствор на
физиологическом растворе. Смесь подогревают в водяной бане при
температуре 100 град. до полного расплавления, затем к остуженному
до температуры 60 град. агару прибавляют мертиолят из расчета
1:10000 и разливают в сосуды.
Сосуды с агаром хранят под резиновой пробкой. Перед
употреблением агар разогревают в водяной бане до полного
расплавления. Затем охлаждают до температуры 70 град. и заливают
на стекло или чашку Петри слоем 3 мм.
5. Определение спектра лекарственной
чувствительности выделенных культур
А. Определение чувствительности к антибиотикам
Чувствительность к антибиотикам определяют методом бумажных
дисков. В стерильные чашки Петри наливают по 20 мл расплавленной
среды /20%/ сывороточный агар/. Чаши подсушивают в термостате или
в термальной комнате с приоткрытыми, донышками кверху, крышками в
течете 20 минут. На поверхность подсушенной среды с помощью мерной
пипетки наносят 0,1 мл взвеси менингококков в физиологической
растворе густотой 10 млрд /мл/ по оптическому стандарту мутности
Государственного института стандартизации и контроля медицинских и
биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича МЗ СССР/.
Суспензию тщательно с помощью шпателя Дригальского круговыми
движениями втирают в поверхность среды так, чтобы не осталось
незасеянных участков. Если влага впитывается плохо, рекомендуется
чашки поместить в термостат с закрытыми крышками на 1 час. После
того, как жидкость хорошо впиталась в поверхность воды, можно
проводить дальнейшие исследования.
Прежде чем приступить к работе, следует вначале вскрыть флакон
с дисками и высыпать содержимое в отдельную стерильную чашку
Петри. На крышке чашки написать название антибиотика (в таком
состоянии диски можно хранить в течение месяца). Приготовленные
для работы диски располагают с правой стороны от работающего;
чашки, засеянные штаммами менингококка, - с левой.
На поверхность чашки, засеянной штаммом менингококков,
накладывают диски с одним антибиотиком, затем с другим и т.д.
Диски раскладывают с помощью обожженного пинцета (глазного или
анатомического).
Каждая чашка может служить для испытаний 4-6 антибиотиков в
зависимости от чувствительности к ним испытываемых штаммов.
Для избежания слияния зон задержки роста от разных дисков с
антибиотиками на одной чашке рекомендуют при первой серии опытов
раскладывать не более 4 дисков на максимальном удалении друг от
друга.
В дальнейшем по мере приобретения опыта количество дисков
можно увеличить. Диски раскладываются на расстоянии 1 см от края
чашки. При этом следует добиваться плотного прилегания дисков к
среде. Чашки оставляют при комнатной температуре на 80 минут, а
затем инкубируют в термостате при температуре 87 град. в течение
16-18 часов. Результат учитывают путем измерения диаметра зон
задержки роста вокруг диска вместе с диаметром диска. Отсутствие
зон задержки роста вокруг диска свидетельствует о том, что
испытываемый штамм не чувствителен к данному антибиотику.
Б. Определение чувствительности
к сульфаниламидам
Приготовление маточного раствора сульфамида (расчет на 100 мл,
при пересчете исходить из требуемого количества):
- отвесить 100 мг чистого сульфонамида (сульфодимезин);
- понемногу добавить 0,1 NаОН в количестве, достаточном для
растворения сульфонамида в течение 1-2 часов при встряхивании
Требуется разное количество NаОН - от 4 до 6 мл.
- довести до 100 мл дистиллированной водой.
Приготовление разведений:
А - маточный раствор
В - маточный раствор - 5 мл (1:2)
дистиллированной воды - 5 мл
С - маточный раствор - I мл (1:10)
дистиллированной воды - 9 мл
Д - раствор С - 1 мл
дистиллированной воды - 9 мл
Получение сульфонамидограммы
К 18 мл расплавленного и остуженного до температуры 45-50
град. сывороточного агара из расчета на 1 чашку добавляют
соответственно:
2 мл распора А - конечная концентрация 100 мг/л,
2 мм раствора В - конечная концентрация 50 мг/л,
2 мл раствора С -"- 10 мг/л,
2 мл раствора Д -"- 1 мг/л.
Сывороточный агар охлаждают в чашках Петри, которые перед
употреблением сушат в термостате.
Штамм засевают бляшками диаметром 1 см. Обязателен посев
штамма на сывороточную среду для контроля. На одной чашке можно
посеять от 8 до 20 штаммов. Результат учитывают через 24 часа
инкубации в термостате при температуре 87 град. Внимательно
сравнивают рост культуры на среде с сульфаниламидами и в контроле,
а также с каждой концентрацией сульфаниламидов. Определяют МБК -
минимальную бактерицидную концентрацию - ту минимальную
концентрацию сульфаниламида, при которой отмечают полное
подавление роста. Концентрацию 50 мг/мл считают пороговой.
Приложение N 2
1. Определение продукции нитратов и нитритов
Приготовление нитратного бульона
К NO3 - 1,0 г
Бактопептон - 5,0 г
Вода дистиллированная - до 100 мл
рН = 7,4
Приготовление нитритного бульона
К NО2 - 0,1 г
Бактопептон - 5,0 г
Вода дистиллированная - до 1000 мл
рН = 7,4
Приготовление раствора А
8 г сульфаниловой кислоты растворить в 1000 мл уксусной
кислоты при слабом нагревании.
Приготовление раствора В
5 г L - нафтиламина растворить в 1000 мл 5 N - укcусной
кислоты при слабом нагревании.
Растворы хранить в посуде из темного стекла с притертыми
пробками.
Нитратный и нитритный бульоны разливают в химически чистые
пробирки с поплавками по 5 мл. Автоклавируют при температуре 115
град. в течение 20 минут. Перед посевом культур в среды добавляют
20% инактивированной сыворотки. Посевы выдерживают в термостате в
течение 5-7 дней. После инкубации в каждую пробирку с культурой
вносят по 0,1 мл смеси реактивов А и В, которые смешивают
непосредственно перед употреблением (или по 5 капель обоих
реактивов).
Учет редукции нитратов
Появление красного окрашивания через 30 секунд после
добавления смеси реактивов А и В свидетельствует о редукции
нитратов до нитритов.
При отсутствии окрашивания в пробирку добавляют на кончике
скальпеля (5 мг/мл) порошок металлического цинка и результат
оценивают по схеме:
- окраска не проявляется - нитраты в среде отсутствуют, так
как редуцированы бактериями до нитритов и далее до последующих
продуктов восстановления;
- появляется красное окрашивание - нитраты в среде
редуцированы до нитритов, но не бактериями, а цинком.
Учет редукции нитритов
Красное окрашивание - нитриты присутствуют.
Отсутствие окрашивания - нитриты отсутствуют, т.е.
редуцированы микробами.
2. Определение уреазы по методу Закса
Готовят раствор А: спирт 96 град. - 2 мл, дистиллированная
вода - 4 мл, мочевина - 2 г.
Готовят раствор В: KН2РО4 - 0,1 г, К2НРО4 - 0,1 г, NaCl - 0,5
г, фенол-рот - 0,2% - 1 мл, дистиллированная вода - до 100 мл.
Раствор А автоклавируют в течение 30 минут при 1,5 атм.
Смешивают: 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь
разливают по 0,1 мл в агглютинационные пробирки (стерильно) и
вносят несколько капель испытываемой культуры. Пробирки помещают в
термостат на 80 минут. При наличии у бактерий фермента уреазы
среда приобретает ярко - малиновое окрашивание, при отсутствии -
цвет среды не изменяется.
Общее время наблюдения за реакцией - 18-24 часа (при
отрицательной реакции).
3. Постановка реакции на оксидазу
На поверхность питательной среды в чашку Петри на тот участок,
откуда была взята для отсева подозрительная на N. meninditidis
колония, наносят каплю свежеприготовленного 1% водного раствора
хлористоводородного диметилпарафенилендиамина. Все представители
рода нейссерий под действием реактива розовеют, а затем чернеют и
гибнут.
Указанный реактив может быть заменен диэтилпарафенилендиамином
или диметилфенилендиамином. Горьковский научно - исследовательский
институт эпидемиологии, микробиологии и гигиены выпускает бумажные
оксидазные диски - ВИС. Такой диск может быть помещен на сектор с
посевом чистой культуры, или исследуемая культура нанесена петлей
на увлажненные диски.
4. Постановка реакции на каталазу
Реакцию производят путем нанесения одной капли 3% или 10%
свежеприготовленного раствора перекиси водорода из перегидроля на
поверхность посева исследуемой культуры. Появление на поверхности
посева пузырьков газа свидетельствует о положительной реакции.
В случае отсутствия активности при внесении перекиси на
культуру следует провести реакция на предметном стекле, смешав
культуру с каплей перекиси. Эту пробу нельзя ставить с культурой,
pacтущей на кровяном агаре, так как наличие в субстрате
питательной среды фермента каталазы может дать ложную
положительную реакцию. В этих случаях реакцию ставят на предметном
стекле в капле перекиси.
5. Бета - галактозидазная активность
/ONPY/<*>
Бета - галактозидазную активность гемофильных бактерий можно
определить либо с помощью импрегнированных дисков, либо в среде,
содержащей ONPY. При отсутствии в лаборатории реактивов ОNPУ бета
- галактозидазная активность может быть определена по расщеплению
агара, содержащего 5% лактозы.
--------------------------------
<*> - ONPY - О - nitrophenyl - B - D - dalactophyranoside.
Приготовление среды: 6 г ONPY растворяют в 1000 мл 0,01 М
Na2HPO4 pH = 7,5, стерилизация - фильтрацией через фильтр Зейца.
Хранить в рефрижераторе. Стерильно добавляют 250 мл среды ONPY к
750 мл пептонной воды и разливают по 2 мл в пробирки. Среду хранят
1 месяц. Пробирки со средой засевают взвесью испытываемых микробов
и инкубируют 24 часа /учет реакции начинают вести через 14 минут
инкубации/. Положительную реакцию определяют по появлению ярко -
желтого окрашивания за счет О - нитрофенола.
При использовании импрегнированных дисков<*> во взвесь
микробов в дистиллированной воде вводят диск, затем инкубируют в
течение 24 часов. Результаты учитывают как со среды -
галактозидазной активностью или расщеплением агара с 5 % лактозы
обладают все гемофилы, за исключением вида Н.
--------------------------------
<*> - импрегнированные диски выпускает Горьковский научно -
исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии МЗ СССР.
Настоящие методические указания составлены сотрудниками:
Центрального института эпидемиологии М3 СССР, Государственного
института стандартизации и контроля медицинских биологических
препаратов им. Л.А. Тарасевича, Института эпидемиологии и
микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.
В методических указаниях учтены предложения сотрудников:
Института эпидемиологии и микробиологии МЗ СССР им. Г.М.
Габричевского, кафедры инфекционных болезней медицинского
факультета Вильнюсского университета, Ашхабадского института
эпидемиологии и гигиены им. С.М. Дурсуновой, Львовского института
эпидемиологии и микробиологии, Казанского института эпидемиологии
и микробиологии, Армянского института эпидемиологии, вирусологии и
медицинской паразитологии им. акад. А.Б. Алексаняна, санитарно -
эпидемиологической станции гг. Москвы и Ленинграда.
Начальник Главного
управления карантинных
инфекций Минздрава СССР
В.П.СЕРГИЕВ
|
